Применение аутологичных клеток пуповинной крови у новорожденных с гипоксически-ишемической энцефалопатией

Гипоксия-ишемия головного мозга является основной причиной перинатальных неврологических повреждений. Несмотря на высокий уровень медицинской помощи в акушерстве, неонатологии и значительные успехи в профилактике осложнений родов, умеренная и тяжелая гипоксически-ишемическая энцефалопатия (ГИЭ) у новорожденных детей по-прежнему встречается с частотой 1–2 на 1000 родившихся. До недавнего времени стратегия ведения таких пациентов заключалась в поддерживающей терапии дисфункции органов. В течение последних трех десятилетий активные исследования на животных, а впоследствии и людях убедительно продемонстрировали, что индуцированная системная гипотермия (поддержание температуры тела ребенка с 6 часов после рождения в течение 72 часов на уровне 33,5°С) эффективно улучшает неврологическую картину у детей с ГИЭ. С 2010 года такая терапия стала стандартом лечения ГИЭ [1, 2, 3]. К сожалению, даже после применения индуцированной гипотермии у значительной части младенцев с ГИЭ все еще остаются неврологические расстройства различной степени тяжести, диагностируемые в течение двух лет жизни [4]. Поэтому продолжаются поиски других подходов, которые могут способствовать улучшению результатов лечения таких пациентов.

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ПРИ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Интерес к заместительной клеточной терапии при неврологических заболеваниях имеет долгую историю. Еще сорок лет назад было проведено много исследований по нейротрансплантации на животных [5]. Другие менее исследованные стратегии нейрорегенерации предусматривают стимуляцию эндогенных нейральных стволовых клеток. Многообещающими оказались результаты двух двойных слепых рандомизированных контролируемых клинических испытаний по трансплантации эмбриональных стволовых клеток при болезни Паркинсона, хотя первоначальные цели терапии достигнуты ни были [6, 7]. Обнадеживающим в этих исследованиях стал тот факт, что имплантированные клетки эмбрионального происхождения успешно прижились и образовывали отростки. Тем не менее перенесение результатов исследований на уровень рутинной терапии пока еще вызывает значительные проблемы.

Другим важным моментом при использовании фетальных тканей, наряду с клинической эффективностью, являются вопросы медицинской этики. Обойти спорные политические и юридические препятствия можно, обратившись к альтернативным источникам стволовых клеток. Это ксеногенные фетальные клетки, иммортализованные клеточные линии, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, стромальные стволовые клетки из жировой ткани, стволовые клетки плаценты и пупочного канатика, клетки пуповинной крови и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки [8].

КЛЕТКИ ПУПОВИННОЙ КРОВИ

Пуповинная кровь богата стволовыми клетками, в том числе мезенхимальными. Впервые, несмотря на первоначальный скептицизм, успешная трансплантация клеток пуповинной крови человека была проведена в 1988 году для лечения ребенка с анемией Фанкони. Сегодня это уже общепризнанный метод лечения многих видов рака крови и генетических гематологических заболеваний. По приблизительным оценкам, к 2015 году ежегодно во всем мире будет проводиться 10 000 трансплантаций пуповинной крови с использованием сохраненных ранее клеток.

У пуповинной крови как источника плюрипотентных стволовых клеток имеется много очевидных преимуществ. Обычно такая кровь после рождения ребенка уничтожается как биологические отходы, в то время как ее можно легко собрать, а сама процедура забора безопасна для донора. Благодаря низкой иммуногенности клеточные трансплантаты из пуповинной крови более толерантны относительно несоответствия по HLA и таким образом имеют более низкий уровень реакции «трансплантат против хозяина» по сравнению со стволовыми клетками костного мозга.

В моделях на животных с индуцированным инсультом инфузии клеток пуповинной крови человека продемонстрировали некоторые важные свойства: введенные клетки мигрируют к очагу повреждения, уменьшают размер зоны инфаркта, а также приводят к функциональному улучшению неврологических функций животных [9, 10, 11]. Также было показано, что введенные внутривенно клетки пуповинной крови пациентам с болезнью Краббе пересекли гематоэнцефалический барьер и прижились в тканях головного мозга реципиентов [D. Kurtzberg, личное общение].

ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПОЗИТИВНЫХ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ВВЕДЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Вопреки общепринятой логике пересаженные клетки, вероятно, реализуют позитивные эффекты главным образом за счет размножения, дифференцировки и замены утраченных вследствие болезни нейронов [12]. Одним из возможных механизмов является паракринное влияние через секрецию нейротрофических факторов, которые помогают стимулировать размножение эндогенных нейральных предшественников [13, 14]. Клетки пуповинной крови способны защитить нейроны коры головного мозга от глутамат-индуцированного апоптоза за счет активации сигнального пути протеинкиназы В [15]. Это особенно актуально для терапии гипоксически-ишемической энцефалопатии, так как в основе успешного лечения таких детей лежит предотвращение отсроченной гибели клеток после острого гипоксически-ишемического инсульта. Клетки пуповинной крови также улучшают выживаемость олигодендроцитов за счет изменения экспрессии генов [16].

На модели травмы спинного мозга у крыс трансплантированные мультипотентные стволовые клетки улучшали неврологическую функцию, возможно, продуцируя нейротрофические, ангиогенные и противовоспалительные цитокины, которые уменьшают вторичное повреждение [17]. В экспериментах invitro продемонстрирована способность мононуклеарных клеток пуповинной крови секретировать интерлейкины, факторы роста и белки хемотаксиса [18].

ПИЛОТНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК АУТОЛОГИЧНОЙ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НОВОРОЖДЕННЫХ С ГИПОКСИЧЕСКИ-ИШЕМИЧЕСКИМ ПОВРЕЖДЕНИЕМ ГОЛОВНОГО МОЗГА

Весьма перспективной является ранняя клеточная терапия гипоксически-ишемического повреждения головного мозга у новорожденных на 1–6-е сутки рождения. Это связано с тем, что доступность аутологичной пуповинной крови после рождения ребенка позволяет провести инфузию стволовых клеток сразу же после повреждения головного мозга, особенно в фазу реперфузии. Кроме того, в этом случае не возникает никаких проблем несовместимости с HLA. А жизнеспособность ядросодержащих клеток свежей пуповинной крови выше, чем криоконсервированных единиц.

Подобные пилотные исследования безопасности и возможностей клеточной терапии были проведены в Сингапуре в сотрудничестве с Cottonetal . (Университет Дьюка) как инициаторами клинического испытания аутологичных клеток пуповинной крови у новорожденных с ГИЭ [19, 20]. В течение двух лет детям с ГИЭ, нуждающимся в терапевтической гипотермии, проводилась трансфузия аутологичной пуповинной крови. Для получения фракции ядросодержащих клеток собранная единица пуповинной крови была уменьшена в объеме и лишена эритроцитов. Фракция ядросодержащих клеток не замораживалась и была разделена на четыре образца по 5 мл каждый. Каждый образец вводили на 12, 24, 48 и 72-й часы жизни ребенка. Мы показали, что после обработки некриоконсервированной фракции ядросодержащих клеток пуповинной крови их жизнеспособность через 96 часов составляла 91,3 % (фракция CD34⁺ клеток – 93,3 %).

В исследовании участвовали двое детей с ГИЭ ІІ стадии (по Sarnat), судорогами, и прогнозом развития ДЦП. Аутологичная пуповинная кровь была введена в соответствии со схемой: 6 и 156 млн клеток/кг для каждого ребенка. Никаких побочных реакций, связанных с трансфузией, выявлено не было. У обоих новорожденных на магнитно-резонансных томограммах присутствовали начальные изменения в головном мозге, но при следующем исследовании в возрасте 4–6 месяцев жизни они отсутствовали. В первом случае ребенок в возрасте одного года развивается нормально. Во втором – у ребенка остается значительная задержка моторного развития с некоторым когнитивным дефицитом.

Для оценки клинической эффективности такого лечения необходимы дальнейшие исследования. Проблемами, с которым столкнутся исследователи, могут стать этические вопросы привлечения плацебо-контролируемых групп, а также возможные трудности сбора достаточного количества пуповинной крови, особенно если требуется предварительное информированное согласие родителей. Кроме того, для получения фракции стволовых клеток пуповинной крови надлежащего качества и своевременного их введения аккредитованные банки пуповинной крови должны располагаться в непосредственной близости от роддомов, то есть на расстоянии 1–2 часов от родильного дома.

Литература

1. Gunn A.,еt al. Dramatic neuronal rescue with prolonged selective head cooling after ischemia in fetal lambs// J. Clin. Invest. – 1997. – 99. № 2. – P. 248.
2. Edwards A., et al. Neurological outcomes at 18 months of age after moderate hypothermia for perinatal hypoxic ischaemic encephalopathy: synthesis and metaanalysis of trial data // BMJ: British Medical Journal. – 2010. – 340. – P. 363.
3. Perlman J.,еt al. Neonatal resuscitation: 2010 international consensus on cardiopulmonary resuscitation and emergency cardiovascular care science with treatment recommendations // Pediatrics. – 2010. – 126, № 5. – P. 1319–1344.
4. Jacobs S., et al. Whole-body hypothermia 1pr term and near-term newborns with hypoxic-ischemic encephalopathy: a randomized controlled trial // Arch. Pediat. Adol. Med. – 2011. – 165, № 8. – P. 692.
5. Das G., Altman J. Transplanted precursor: of nerve cells: their fate in the cerebellums of young rats // Science. – 1971. – 173, № 3997. – P. 637–638.
6. Freed C., et al. Transplantation of embryonic dopamine neurons for severe Parkinson's disease // New Engl. J. Med. – 2001. – 344, N 10. – P. 710–719.
7. Olanow C.,еt al. A double-blind controlled trial of bilateral fetal nigral transplantation in Parkinson's disease // Ann. Neurol. – 2003. – 54, № 3. – P. 403–414.
8. Trounson A., et al. Clinical trials for stem сell therapies // BMC Med. – 2011. – 9, № 1. – P. 52.
9. Chen J., et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats // Stroke. – 2001. – 32, № 11. – P. 2682–2688.
10. Meier C., et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells // Pediat. Res. – 2006. – 59, N 2. – P. 244–249.
11. Pimentel-Coelho P., et al. Human cord blood transplantation in a neonatal rat model of hypoxic-ischemic brain damage: functional outcome related to neuroprotection in the striatum // Stem Cells Dev. – 2010. – 19, № 3. – P. 351–358.
12. Snyder E., et al. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex // Proc. Nat. Acad. Sci. – 1997. – 94, № 21. – P. 11663–11668.
13. Qurednic J., et al. Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons // Nat. biotechnol. – 2002. – 20, № 11. – P. 1103–1110.
14. Ben-Shaanan T., Ben-Hur T., Yanai J. Transplantation of neural progenitors enhances production of endogenous cells in the impaired brain // Mol. Psychiatr. – 2007. – 13, № 2. – P. 222–231.
15. Dasari V., et al. Neuroprotection by cord blood stem cells against glutamate-induced apoptosis is mediated by Akt pathway // Neurobiology of disease. – 2008. – 32, № 3. – P. 486–498.
16. Rowe D., et al. Cord blood administration induces oligodendrocyte survival through alterations in gene expression // Brain res. – 2010. – 1366. – P. 172–188.
17. Chua S., et al. The effect of umbilical cord blood cells on outcomes after experimental traumatic spinal cord injury // Spine. – 2010. – 35, № 16. – P. 1520–1526.
18. Neuhoff S., et al. Proliferation, differentiation, and cytokine secretion of human umbilical cord blood-derived mononuclear cells in vitro // Exp. Hematol. – 2007. – 35, № 7. – P. 1119–1131.
19. Liao Y., et al. Rescuing the neonatal brain from hypoxic injury with autologous cord blood // Bone Marrow Transplantation. – 2013. – 48, № 7. – P. 890–900.
20. National University Hospital, Singapore. Autologous cord blood cells for brain injury in term newborns. In: Clinical Trials.gov. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US). 2000 – NLM Identifier: NCT01649648 [cited 2013 Sep 03]. – Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01649648.

Регенеративная терапия стволовыми клетками пуповинной крови открывает большие перспективы в лечении острых повреждений головного мозга у новорожденных, в том числе и гипоксически-ишемических поражений. Доклинические и клинические исследования указывают на успехи в этом направлении. Механизм позитивного действия клеток состоит, скорее всего, в нейротрофических и нейропротекторных эффектах, а не в замене нейронов. Поэтому требуются глубокие фундаментальные исследования в области биологии стволовых клеток.

Необходимо также провести правильно спланированные клинические исследования. Одним из очевидных вариантов выбора стволовых клеток, с учетом высокого уровня безопасности, являются аутологичные клетки пуповинной крови. Учитывая тот факт, что проводить регенеративную терапию стволовыми клетками нужно как можно быстрее после повреждения и родов, надо понимать, что организация и проведение таких исследований будут достаточно сложными и затратными.

Литература

1. Carroll J., Borlongan C. Adult Stem Cell Therapy for Acute Brain Injury in Children // CNS & Neurological Disorders. – Drug Targets. – 2008. – 7. – P. 1–8.
2. Keene C., Ortiz-Gonzalez X., Jiang Y. et at. Neural differentiation and incorporation of bone marrow-derived multipotent adult progenitor cells after single cell transplantation into blastocyst mouse embryos // Cell Transplantation. – 2003. –12. – P. 201–213.
3. Yamagata M., Yamamoto A., Kako E. et at. Human dental pulp-derived stern cells protect against hypoxic-ischemic injury in neonatal mice // Stroke. – 2013. – 44. – P. 551–554.
4. Lee I., Jung K., Kim M., et al. Neural stem cells: properties and therapeutic potentials for hypoxic-ischemic brain injury in newborn infants // Pediatrics International. – 2010. – 52. – P. 855–865.
5. Takahashi K., Yamanaka S. Induced pluripotent stem cells in medicine and biology// Development. – 2013. – 140. – P. 2257–2267.
6. Bartley J., Soltau T., Wimbourne H., et al. BrdU-positive cells in the neonatal mouse hippocampus following hypoxic-ischemic brain injury BMC Neuroscience. – 2005. – 6. – P. 63–74.
7. Donega V, van Velthoven CT, Nijboer CH, et al. The endogenous regenerative capacity of the damaged newborn brain: boosting neurogenesis with mesenchymal stem cell treatment // J. Cerebral Blood Flow & Metabolism.– 2013.– 33. – P. 625–634.
8. Rice J., Vannucci R., Brierly J. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat // Ann Neurol. – 1981. – 9. – Р.131–141.
9. Donega V., van Velthoven C., Nijboer C., et al. Intranasal mesenchymal stem cell treatment for neonatal brain damage: long-term cognitive and sensorimotor improvement // PLoS ONE. – 2013. – 8. – P. e51253.
10. Rosenblum S., Wang N., Smith T., et al. Timing of intra-arterial neural stem cell transplantation after hypoxia… differentiation // Stroke. – 2012. – 43. – P. 1624–1631.
11. Park S., Koh S. E., Maeng S., et al. Neural progenitors generated from mesenchymal stem cells of first- trimester human placenta matured in the hypoxic-ischemic rat: brain and mediated restoration of locomotor activity // Placenta. – 2011. – 32. – P. 269–276.
12. Lee J., Kim B., Jo C., et al. Mesenchymal stem-cell transplantation for hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rat model // Pediatric research. – 2010. – 67. – P. 42–46.
13. De Paula S., Greggio S., Marinowic D., et al. The dose-response effect of acute intravenous umbilical cord blood cells on brain damage and neonatal hypoxia ischemia // Neuroscience. – 2012. – 210. – P. 43–66.
14. Kim E., Ahn S., Im G., et al. Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell transplantation attenuates severe brain injury by permanent middle cerebral artery occlusion in newborn rats // Pediatric Research. – 2012. – 72. – P. 277–284.
15. Meier C., Middelanis J., Wasielewski B., et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells // Pediatric Research. – 2006. – 59. – P. 244–249.
16. Yasuhara T., Matsukawa N., Yu G., et al. Transplantation of cryopreserved human bone marrow-derived multipotent adult progenitor cells of neonatal hypoxic-ischemic injury: targeting the hippocampus // Reviews in the Neurosciences. – 2006. – 17. – P. 215–225.
17. Yasuhara T., Hara K., Maki M., et al. intravenous grafts recapitulate the neuronestoration afforded by intracerebrally delivered multipotent adult progenitor cells in neonatal hypoxic-ischemic rats//J. Cerebral Blood Flow and Metabolism. – 2008. – 28. – P. 1804–1810.
18. Van Velthoven C., Kavelaars A., van Bel F., Heijnen C. Nasal administration of stem cells: a promising novel route for ischemic brain damage // Pediatric Research. – 2010. – 68. – P. 419–422.
19. Carroll J. Human cord blood for the hypoxic-ischemic reonate // Pediatric Research. – 2012. – 71. – P. 459–463.
20. Van Velthoven C., Kavelaars A., Heijnen C. Mesenchymal stem cells as a treatment for neonatal ischemia // Pediatric Research. – 2012. – 71. – P. 474–481.
21. Erices A., Conget P., Minguell J. Mesenchymal progenitor cell in human umbilical cord blood // British Journal of Haematology. – 2000. – 109. – P. 235–242.
22. Zhao L., Duan W., Reyes M., et al. Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotypes and ameliorate neurological deficits after grafting into the ischemic brain of rats // Experimental Neurology. – 2002. – 174. – P. 11–20.
23. Van Velthoven C., Kavalaars A., van Bel F., et al. Mesenchymal stem cell transplantation changes the gene expression of the neonatal ischemic brain // Brain, Behavior & Immunity. – 2011. – 25. – P. 1342–1348.
24. Daadi M., Davis A., Arac A., et al. Human neural stem cell grafts modify microglial response and enhance axonal sprouting in neonatal hypoxic-ischemic brain injury. – Stroke. – 2010. – 41. – P. 516–523.
25. Wasielewski B., Jensen A., Roth-Harer A., et al. Neuroglial activation and CX43 expression are reduced upon transplantation of human umbilical cord blood cells after perinatal hypoxic-ischemic injury // Brain Research. – 2012.– 1487. – P. 39–53.
26. Borlongan C., Lind J., Dillon-Carter O., et al. Bone marrow grafts restore cerebral blood flow and blood brain barrier in stroke rats // Brain Research. – 2004. – 1010. – P. 108–116.
27. Robinson S., Niu T., de Lima M., et al. Ex vivo expansion of umbilical cord blood // Cytotherapy. – 2005. – 7. – P. 243–250.
28. Van Velthoven C., van de Lootj Y., Kavalaars A., et al. Mesenchymal stem cells restore cortical rewiring after neonatal // Annals of Neurology. – 2012. – 71 – P. 785–796.
29. Luan Z., Liu W., Qu S., et al. Treatment of newborns with severe injured brain with transplantation of human neural precursor cells // Zhonghua Erke Zazhi. — 2011. – 49. – P. 445–449.
30. Luan Z., Yin G., Hu X., et al. Treatment of an infant with severe neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy sequelae with transplantation of human neural stem cells into cerebral ventricle // Zhonghua Erke Zazhi. – 2005. – 43. – P. 580–583.

Д. Ли

Национальный университет системы здравоохранения, Банк стволовых клеток крови пуповины Сингапур