Генной терапией называют изменение генов для лечения заболеваний. Наиболее часто при этом выполняется постоянная интеграция нормального гена в ДНК стволовой клетки. При экспрессии внедренный нормальный ген дает терапевтический эффект за счет замещения или выполнения функции отсутствующего или мутантного гена [1, 3, 9].
В рамках генной терапии проводится изучение возможности вставлять гены в стволовые клетки пуповинной крови (СК-ПК) или стволовые клетки костного мозга (СК-КМ). Замещение генов может оказаться полезным при заболеваниях сердца (инфаркт миокарда, хроническая сердечная недостаточность), гепатологии (хронические гепатиты, циррогзы печени), травматологии и ортопедии, ферментных дефицитах (талассемии, тяжелом комбинированном иммунодефиците (SCID), болезни Гоше и муковисцидозе (МВ), генных нарушениях (серповидно-клеточной анемии), а также для индукции селективной гибели клеток в онкологии (эта методика направлена на раковые клетки, и использует «гены самоубийства»).
В перспективе генная терапия может использоваться для лечения как генетических, так и инфекционных (СПИД) заболеваний. Кроме того, существуют протоколы генной терапии, где внедренный в клетку ген специфическим образом вызывает гибель злокачественных клеток без повреждения нормальных гемопоэтических клеток. Приблизительно 2000 пациентов во всем мире уже участвовали в клинических исследованиях генной терапии по 250 различным протоколам. Для доставки генов в клетки используются различные вирусы. Приблизительно в 60% используемых в настоящее время протоколов применяются ретровирусные векторы, в 12% – аденовирусы и в 1% – аденоассоциированный вирус (ААВ). Однако, в связи с возникновением случаев лейкоза при применении ретровирусов в исследовании генной терапии у пациентов со SCID, набор пациентов в исследования генной терапии замедлился [5].
В свете этих недавно выявленных нежелательных реакциях в клинических исследованиях генной терапии на первый план выходит вопрос обеспечения безопасности пациентов. Кроме того, трудности связаны с разработкой оптимальных методов доставки генетического материала в клетку, переноса ДНК в ядро и индукции экспрессии вставленного гена. В зависимости от конкретных задач, для некоторых генов требуется долговременная экспрессия (замещение недостающего гена глобина при талассемии), и поэтому требуется их введение в геномную ДНК клеточной популяции, которая проживет достаточно долго. Для других генов может требоваться лишь транзиторная экспрессия (для индукции гибели опухолевых клеток). Для каждой задачи требуются уникальные генетические элементы для вставки в определенные векторы, обеспечивающие определенный уровень экспрессии гена в необходимой ткани. При генной терапии может производиться замещение отсутствующего или поврежденного гена или создаваться антисмысловая или рибосомная РНК, что обеспечивает желаемый терапевтический эффект за счет изменения образования продуктов эндогенных генов [7].
Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), СК-ПК и СК-КМ представляют собой хороший объект для исследований генной терапии. Их можно легко получить и инкубировать ex vivo с векторами, содержащими генетический материал. Кроме того, поскольку ГСК циркулируют в организме, их можно использовать для доставки генов при негематологических заболеваниях. В идеале, требуется только инфицировать «стволовую» клетку, чтобы получить значительную амплификацию и длительную направленную экспрессию трансгена.
Векторы для генной терапии могут действовать на клетки ex vivo, после чего клетки вводят обратно пациенту, или векторы могут вводиться напрямую пациенту и действовать in vivo. До настоящего времени в большинстве исследований на животных и человеке использовалось инфицирование клеток ретровирусами ex-vivo. Это позволяет перед использованием отбирать клетки, инфицированные вирусом. Инфицирование in vivo использовалось преимущественно в клинических исследованиях лечения больных МВ. Пациентам давали вдыхать аденовирусные векторы с геном, который несет мутацию при МВ (ген белка ионного канала CFTR), после чего вирус инфицирует клетки дыхательного эпителия. Недостатком аденовирусных векторов является участие в процессе механизмов иммунной системы, которые быстро разрушают векторы in vivo. Кроме того, проводится интенсивное изучение невирусных векторов для генной терапии. К разрабатываемым невирусным технологиям относятся липосомы и прямое введение путем инъекции генной пушкой; эти методы не вызывают такой реакции иммунной системы, как использование вирусных векторов [4].
В идеале вектор должен обладать следующими характеристиками:
- способностью переносить крупный ген;
- контролируемой инфицирующей способностью;
- направленностью на определенную мишень;
- возможностью программирования направленности своего действия;
- высокой эффективностью инфицирования;
- контролируемой, персистирующей ткань-специфической экспрессией;
- отсутствием способности к репликации in vivo;
- контролем места интеграции, что позволяет предотвратить неспецифическое действие;
- низкой иммуногенностью;
- отсутствием цитотоксического действия;
- низкой вероятностью возникновения осложнений у пациентов.
Ни один из существующих в настоящее время векторов не соответствует этим требованиям полностью. В данном кратком обзоре основное внимание обращается на биологию трех наиболее хорошо изученных векторных систем, которые использовались в клинических исследованиях по инфицированию гемопоэтических клеток – ретровирусы, адено-ассацированный вирус (ААВ) и аденовирусы [10].
По определению, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) способны к самообновлению и дифференцировке в более дифференцированные виды клеток. В костном мозге существуют два вида стволовых клеток: ГСК, ответственные за образование клеток крови, и МСК. МСК, которые иногда называют стромальными клетками костного мозга, обеспечивают поддержку ГСК. Как и другие стволовые клетки, МСК способны к самообновлению и дают начало, множеству линий мезодермальных клеток, включая остеоциты, хондроциты, адипоциты и гладкомышечные клетки [11]. МСК легко поддаются выделению из костного мозга и культивированию in vitro.
Проведенная недавно работа была направлена на установление роли МСК в клинической терапии. МСК обладают несколькими характеристиками, которые делают их привлекательными для клинического применения. Во-первых, их можно выделить и культивировать in vitro. Во-вторых, они обладают иммуномодулирующими свойствами. В-третьих, они легко поддаются трансдукции вирусными и невирусными векторами. В-четвертых, существуют данные, что экзогенные МСК после введения направляются в очаги воспаления и участвуют в заживлении ран.
МСК в наибольшем количестве встречаются в костном мозге. Их также можно обнаружить в пуповинной крови, плаценте и амниотической жидкости. После получения аспирата костного мозга фракцию мононуклеарных клеток помещают в пластиковые колбы для культивирования, где МСК растут, прикрепляясь к пластику. Через 3–5 дней культивирования неприкрепившиеся клетки (в основном, ГСК) смывают. Приблизительно 70–85% оставшихся прикрепленных клеток представляют собой МСК. При проведении дополнительных пассажей доля МСК возрастает до 90–95%. В то же время, МСК, не являются бессмертными в культуре. Большинство лабораторий могут поддерживать культуру МСК на протяжении пяти-шести пассажей, и при этом отмечается пролиферация до 40 поколений.
МСК приживаются в очагах воспаления и заживления ран. Например, у животных с переломами костей при инфузии МСК происходит их хоуминг в область перелома. МСК после введения мышам с разорванной брюшиной оседают в месте повреждения брюшины. Как и в случаях переломов костей и повреждения брюшины, метастатические опухоли находятся в микроокружении воспаления и заживления. В одном исследовании МСК, меченные флуорецсентным красителем, вводили мышам с подкожной меланомой. На 2 и 3 день после инфузии МСК обнаруживались в легких, красной пульпе селезенки, печени и в опухоли. Еще через 7 дней легкие, селезенка и печень больше не содержали МСК. В то же время, МСК сохранялись в опухоли. Максимальное содержание МСК в опухоли отмечалось в некротизированном центре и в растущих краях опухоли. В этих областях наиболее выражено воспаление. В данном исследовании здоровая ткань не способствовала хоумингу и/или приживлению МСК.
МСК очень перспективны в отношении использования, как средств доставки белков для терапии. Для трансдукции МСК использовали несколько разных вирусных векторов. Ретровирусные векторы использовали для экспрессии таких белков, как α-галактозидаза [11], зеленый флуоресцентный протеин [12, и факторы свертывания крови VIII и IX [12]. Особый интерес для лечения опухолей представляют такие модификаторы, как интерферон и фактор некроза опухолей. Было выдвинуто предположение, что МСК, трансдуцированные этими молекулами, можно вводить больным злокачественными новообразованиями. Злокачественные клетки, которые создают микроокружение воспаления и заживления раны, могут привлекать трансдуцированные МСК, что приводит к повреждению патологических клеток.
Наконец, МСК обладают иммуномодулирующими свой$ ствами, которые могут оказаться полезны пациентам, которым проводится трансплантация костного мозга. МСК обладают способностью подавлять пролиферацию лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов. Этот эффект является дозозависимым. Отношение МСК: лимфоциты 1:10 или более приводит к подавлению лимфоцитов. Этот эффект может быть опосредован МСК-индуцированной супрессией развития цитотоксических CD8 лимфоцитов. Поскольку наблюдалось, что введенные МСК направляются в костный мозг, считается, что инфузия МСК после миелоаблятивной химиотерапии может обеспечить формирование стромы, необходимой для гемопоэтических клеток, что позволяет ускорить их приживление. В то же время, в большинстве исследований, где изучался этот вопрос, не было показано долгосрочное приживление МСК у реципиентов после трансплантации костного мозга. Интересно, что было показано, что МСК подавляют реакцию трансплантат против хозяина (РТПХ) при их одновременной трансплантации с аллогенными клетками костного мозга.
МСК – это плюрипотентные стволовые клетки, которые находятся в костном мозге, но также обнаруживаются в периферической крови (редко), пуповинной крови, плаценте и амниотической жидкости. Их клиническое применение очень перспективно. В то же время, об этих клетках еще предстоит многое узнать. Было определено несколько поверхностных маркеров МСК, но их точный иммунофенотип пока не установлен. Вопрос о лучшей среде для культивирования МСК также находится в стадии обсуждения. В разных лабораториях имеются разные данные о том, через сколько поколений МСК можно выделить из культуры. Тем не менее, МСК представляют собой популяцию клеток, которые можно выделять, в различных лабораториях, трансдуцировать, а потом вводить реципиентам. Доставка противоопухолевых белков и ускорение приживления трансплантата костного мозга у реципиентов – это только несколько примеров потенциального клинического применения этих важных клеток.
В экспериментальных моделях с использованием человеческих и мышиных мультипотентных клеток-предшественников взрослого организма (MAPCs) их мультипотентность была продемонстрирована в нескольких аспектах. Эти клетки получают одновременно с МСК костного мозга при их очистке, и они составляют очень редкую подгруппу, которая может давать начало эктодермальным, мезодермальным и энтодермальным росткам. В данном обзоре рассматриваются методики выделения MAPCs, их плюрипотентные свойства и возмодное терапевтическое применение этой популяции клеток, обладающих высокой пластичностью.
В то время как гемопоэтические клетки-предшественники (ГКП) обычно можно отделить от клеток крови и костного мозга, используя поверхностные маркеры клеток и/или проточную цитометрию, MAPCs выделяют при помощи сложных протоколов культивирования. После сбора из цельного костного мозга удаляют дифференцированные клетки крови CD45+/GlyA+. Оставшиеся клетки составляют примерно 0,1–0,5% цельного костного мозга. Затем эти клетки подвергают дальнейшей очистке методом культивирования с высокой плотностью с использованием определенных факторов роста и питательной среды для сохранения недифференцированного фенотипа. При флуоресцентной сортировке клеток (FACS) после 15 делений у них обнаруживается отсутствие многих клеточных маркеров, включая маркеры клеток эндотелия, маркеры стволовых клеток, панлейкоцитарный антиген, маркеры HLA и антигены главного комплекса гистосовместимости 1 класса. Они экспрессируют в небольшом количестве β2-микроглобулин, антиген CD44 и рецептор VEGF-2, а также в большом количестве CD 13 и VLA$2. Их морфология в значительной степени зависит от используемой питательной среды. При выращивании описанным выше методом клетки имеют крупный размер и содержат вакуоли. Кроме того, они могут сохранять свой фенотип после более чем 50 делений без заметного укорочения теломер. Образующаяся в результате популяция составляет примерно 0,02–0,08% от исходной подгруппы CD45-/GlyA-. Неясно, способствует ли длительное культивирование увеличению количества исходно имевшихся мультипотентных клеток или оно является обязательным условием индукции пластичности в этой исчезающее малой части клеток костного мозга [11].
До недавнего времени MAPCs обнаруживали только в постнатальном костном мозге; однако в последних работах было показано, что они обнаруживаются также в головном мозге и мышцах мышей. Эти клетки могут представлять собой MAPCs из костного мозга в циркуляции или ткань-специфические стволовые клетки, обладающие характеристиками MAPC. Для полного понимания сложных биологических процессов, лежащих в основе этого изменения пластичности, потребуется уточнить этот вопрос.
В ранних работах, где описывались человеческие MAPCs, было показано, что изменение условий культивирования влияет на фенотип этих клеток, обладающих высокой пластичностью. Человеческие MAPCs могут превращаться в клетки различных линий мезодермального ростка: остеобласты, хондробласты, адипоциты, клетки стромы, скелетные миофибробласты и эндотелиоциты [9].
В дальнейших исследованиях была установлена способность MAPCs превращаться в клетки всех трех зародышевых листков. Было уже известно, что в культуре MAPCs могут экспрессировать маркеры и проявлять функциональные свойства эндотелиоцитов. Эта пластичность кажется еще более замечательной, когда было показано, что MAPCs могут дифференцироваться с образованием клеток вентральной энтодермы. При культивировании в условиях, обычно используемых для культивирования гепатоцитов, MAPCs человека и грызунов приобретают морфологические признаки, поверхностные клеточные маркеры и функциональный фенотип этих клеток. MAPCs грызунов также могут выступать предшественниками нейроэктодермы, поскольку при культивировании у MAPCs появляются характеристики астроцитов, олигодендроцитов и нейронов. В целом, все большее количество видов клеток, получаемых из MAPCs, дает надежду, что их можно будет использовать в терапии заболеваний различных органов [3].
Пластичность MAPCs изучалась на модели с использованием мышей, где меченные MAPCs вводили в раннюю мышиную бластоцисту. Донорские MAPCs получали у трансгенных мышей, экспрессирующих β-галактозидазу (β-gal) во всех клетках. (При контакте с органическим субстратом клетки с экспрессией b-галактозидазы окрашиваются синим цветом, что позволяет легко визуализировать их). Потомство было химерным с генетическим материалом донора и реципиента. После забоя животных через разные промежутки времени экспрессия mRNA β-gal обнаруживалась в различных органах: в мозге, сетчатке, легких, миокарде, скелетных мышцах, печени, кишечнике, почках, селезенке, костном мозге, крови и коже. При иммунофлуоресцентном анализе на маркеры эпителиальных и гемопоэтических клеток было показано, что наличие генетического материала β-gal в печени, легких и желудочно-кишечном тракте не связано с клетками крови. Было показано, что участие MAPCs в органогенезе носит дозозависимый характер, поскольку введение MAPCs в большом количестве приводило к более выраженной экспрессии β-gal, чем введение одной клетки. Наследование донорских генов за счет изменения зародышевой линии не изучалось в этой системе. Хотя образование большого количества тканей из MAPCs документировано, неясно, как этот подход может использоваться в терапевтических целях у человека.
В моделях ксеногенной и аллогенной трансплантации было показано, что MAPCs способны к ткань-специфическому приживлению. Человеческие MAPCs после трансплантации мышам с иммунодефицитом принимают участие в опухолевом ангиогенезе и образовании нативных сосудов, что подтверждается обнаружением человеческого β2-микроглобулина в мышином эндотелии. Было проведено исследование, где β-gal+ MAPCs вводили мышам с иммунодефицитом, которым не проводилась миелоабляция. Донорские вносили свой вклад в гемопоэз; при этом образовывались β-gal-эксперсирующие клетки крови. Кроме того, небольшое количество эпителиальных клеток донорского происхождения обнаруживались в печени, легких и кишечнике. В отличие от описанной выше модели, где происходило развитие организма, β-gal+ клетки находили в мозге, сердце и мышцах. Облучение в дозах, слишком низких для индукции повреждения тканей, не способствовало приживлению клеток в каком-либо органе. Представляет интерес изучение того, как индукция апоптоза и некроза тканей влияет на пластичность MAPC [7].
Представленные выше интересные данные не дают ответа на два важных вопроса: о возможности применения этих клеток при заболеваниях у человека и о функциональных преимуществах донорских клеток. После того, как эти аспекты будут документированы, можно предвидеть, по меньшей мере, четыре различных подхода к применению MAPCs. Один из них – это мобилизация нативного костного мозга с использованием факторов роста и цитокинов, действие которых направлено на MAPCs, чтобы привлечь их в нормальную, но поврежденную ткань. В этой модели MAPCs выступают в качестве обновляемого пула предшественников тканевых клеток. В то же время, поскольку факторы, управляющие дифференцировкой и хоумингом MAPCs еще не до конца определены, вероятно, эта цель не будет достигнута еще много лет. В качестве другой системы предлагается прямая имплантация наивных или дифференцированных MAPCs в места повреждения тканей, например, введение через катетер в поврежденный миокард или участки нервной системы. Хотя это предложение позволяет обойти проблему хоуминга, по-прежнему остаются открытыми вопросы воздействия микроокружения и относительной труднодоступности некоторых органов. Третий подход к лечению предполагает аллогенную трансплантацию донорских MAPCs реципиентам. Хотя эта идея хороша для использования заболеваний, при которых имеется определенный генетический дефект, при этом пациент подвергается такому же риску инфекции и иммунной реакции, как при трансплантации костного мозга. Наиболее привлекательным подходом может быть манипуляция ауто-логичным костным мозгом ex-vivo с последующей реимплантацией хозяину. Хотя это позволяет обойти много опасностей при трансплантации аутологичного костного мозга, используемые в настоящее время ретровирусные системы трансдукции характеризуются возможностью таких осложнений, как лимфопролиферативные заболевания и лейкозы. Таким образом, хотя использование MAPCs в терапии остается многообещающим, до их применения в лечении заболеваний у человека предстоит разрешить еще много вопросов.
Данные о пластичности MAPCs и клеток костного мозга в целом отражают изменение наших представлений об этих клетках. Принятые ранее представления о ремоделировании и регенерации тканей в настоящее время должны быть расширены, чтобы включить в эту концепцию вклад клеток, происходящих из костного мозга. В исследованиях in-vitro и in-vivo было показано, что MAPCs обладают высокой пластичностью, и эта область исследования представляется очень перспективной в будущем. Эти исследования не будут лишены трудностей, но если у человека удастся так же широко документировать пластичность этих клеток, как у мышей, и если будет показано, что потомство MAPC обеспечивает улучшение функции, следующим этапом будет внедрение этой терапии в клиническую практику.
Трансплантация β-клеток поджелудочной железы
Отрицательный социальный эффект сахарного диабета и его осложнений трудно переоценить. По оценкам, в США число больных диабетом составляет 16 миллионов человек, а во всем мире – 200 миллионов. Это третье по распространенности заболевание и четвертая по значимости причина смерти населения в Северной Америке. Медицинские затраты на лечение сахарного диабета в США в 2002 году превысили 110 миллиардов долларов.
Инъекции инсулина остаются ведущим способом лечения пациентов с I типом сахарного диабета (СД I), и в Исследовании контроля диабета и осложнений (Diabetes Control and Complications Trial) было показано, что контроль гликемии позволяет достоверно снизить частоту возникновения ретинопатии, нейропатии и нефропатии. В опубликованных недавно обзорах результатов трансплантации клеток островков поджелудочной железы было показано, что этот метод в тщательно отобранной группе пациентов с СД I позволяет нормализовать гликемию без потребности в проведении инсулинотерапии.
Ballinger и Lacy сообщили о первом успешном случае изотрансплантации β-клеток островков поджелудочной железы в 1972 году в модели с использованием крыс с сахарным диабетом [17]. После этого поступали сообщения об успешной аутотрансплантации у человека после панкреатэктомии по поводу хронического панкреатита [18]. В то же время, в целом, общая частота успеха при трансплантации островковых β-клеток до 2000 года составляла менее 10%, несмотря на ряд технических достижений, включая усовершенствование выделения β-клеток островков и методик их очистки [19–22]. Среди этих достижений выделяют использование камеры Рикорди и разработку либертазы, что способствовало обогащению суспензии изолированных клеток панкреатических островков. Усовершенствование методик культивирования [18] позволило дополнительно повысить чистоту получаемой клеточной массы. Другие достижения включали усовершенствование методов транспортировки образцов из одного центра в другой, успешное применение донорства после остановки сердца и разработку перфторуглеродной системы для транспортировки органов с «двуслойной» оксигенацией. В целом эти достижения позволили довести показатель независимости от введения инсулина в течение первого года до 50% [23].
Основное улучшение клинических результатов было достигнуто с разработкой Эдмонтоновского протокола. Основное достижение этого протокола связано с отказом от использования кортикостероидов, которые оказывают неблагоприятное действие на клетки островков поджелудочной железы; для успешной иммуносупрессии используется сиролимус, такролимус в низких дозах и даклизумаб (антитела к рецептору IL-2R), и применяется инфузия по меньшей мере двух свежеприготовленных препаратов клеточной массы островков поджелудочной железы в количестве примерно 13000 эквивалентов островков на килограмм массы тела реципиента. Этот протокол был широко принят и в дальнейшем усовершенствован, особенно с успешным развитием протокола инфузии от одного донора.
Поскольку после трансплантации клеток островков вместо инсулинотерапии применяется иммуносупрессия, которая характеризуется собственными рисками. В большинстве центров трансплантация проводится только пациентам с СД I, характеризующимся очень нестабильным течением, у которых интенсивная инсулинотерапия оказалась неэффективной, а также реципиентам аллотрансплантатов солидных органов, которые уже получают иммуносупрессивную терапию.
В большинстве принятых в настоящее время протоколов для трансплантации используется здоровая поджелудочная железа, которую получают у доноров после гибели мозга или остановки сердца, после чего панкреатическую ткань обрабатывают раствором коллагеназы и проводят очистку островковых β-клеток по градиенту плотности. Проводится количественная и качественная оценка [24] выделенных островковых β-клеток, которые должны соответствовать стан$ дартам качества. Одновременно проводится подготовка пациентов с использованием различных средств индукции толерантности. Инфузия одного или более препаратов островковых β-клеток может проводиться в свежем виде или после культивирования в принятой в центре дозе, которую выражают, как отношение числа эквивалентов островков к массе тела пациента (ЭО/кг). В большинстве центров используется введение через систему воротной вены [25], при котором проводится седация пациентов, чрескожное введение ангиографической канюли в воротную вену, системное введение антикоагулянтов и применяется тщательный контроль давления в портальной системе. В схеме иммуносупрессивной терапии обычно обходятся без использования кортикостероидов и ингибиторов кальциневрина в связи с их документированным токсическим влиянием на клетки островков поджелудочной железы.
До настоящего времени не было зарегистрировано случаев смерти больных, связанных с трансплантацией. В последующей публикации Эдмонтоновской группы содержатся сведения об осложнениях, последовавших в 54 процедурах, в том числе о кровотечении (пять случаев), частичном тромбозе воротной вены (два случая), потребности в переливании крови (три случая) и развитии нарастающего внутрипеченочного и субкапсулярного кровотечения, потребовавшего переливания крови и хирургического вмешательства (один случай). К остальным зарегистрированным осложнениям относились повышение показателей функциональных проб печени, гиперхолестеринемия, повышение креатинина, ухудшение протеинурии и развитие или ухудшение течения гипертензии. Также были зарегистрированы побочные эффекты медикаментозной терапии, в том числе тяжелое изъязвление полости рта и глотки, потеря веса, анемия, ускорение развития нефропатии. Отдаленные результаты трансплантации островковых β-клеток пока неизвестны [4].
В настоящее время успешность процедуры тесно коррелирует с опытом того учреждения, где она проводится. В рамках недавно начатой программы Национальных институтов здоровья в США годичный показатель независимости от инсулина составил 50% Для сравнения, годичный показатель независимости от инсулина по данным Эдмонтоновской группы составил примерно 80%, а показатель 3-летнего функционирования трансплантата – 90% по данным публикации 2002 года. В настоящее время проводится многоцентровое исследование трансплантации по Эдмонтоновскому протоколу, чтобы определить возможность воспроизведения их результатов [14].
В связи с большой нехваткой доноров островковых β-клеток в сравнении с потенциальным числом реципиентов в настоящее время проводится крупное исследование для изучения потенциальных суррогатов островковых β-клеток, включая инкапсулированные ксенотрансплантаты, клеточные линии островковых β-клеток человека и эмбриональные стволовые клетки [7].
В результате ряда технических достижений трансплантация β-клеток островков поджелудочной железы в клинической практике стала возможной. Однако в настоящее время об успешном проведении этой процедуры сообщают только крупные центры трансплантации, и для приобретения необходимых технических навыков требуются значительные вложения; метод применяется только в ограниченной группе больных СД I.
Адоптивная иммунотерапия используется в лечении хронических инфекционных или злокачественных процессов. При этом измененные аутологичные клетки используют для стимуляции собственной реактивности организма или для оказания прямого противоопухолевого или цитотоксического действия в организме хозяина [33]. Этот вид терапии основан на предположении, что Т-лимфоциты можно стимулировать к запуску клинически значимого ответа на опухоли или инфекционные агенты. Эта гипотеза подтверждается в моделях с использованием животных и в доклинических исследованиях [13].
Опухоль-специфичная адоптивная Т-клеточная терапия и опухоль-специфичная вакцинация – это два основных подхода к адоптивной иммунотерапии злокачественных опухолей. Для первой требуется экспансия опухоль-специфичных T-лимфоцитов ex vivo, после чего проводится их инфузия пациенту. Второй метод основан на введении модифицированных аутологичных клеток, антигенных белков, пептидов и нуклеиновых кислот опухоли с дендритными клетками (ДК) или генетическим путем с адъювантом или без него.
Использование ДК и антиген-специфичных Т-лимфоцитов представляет собой два примера адоптивной иммунотерапии. В то же время, в обоих случаях проводится выбор тумор-ассоциированных антигенов-мишеней (ТААМ), на которые направлен иммунный ответ. Существует пять основных классов ТААМ: антигены дифференцировки (например, Melan-A/MART-1, gpl00 и тирозиназа при меланоме); неоантигены (например, MAGE при меланоме, раке пищевода, легкого, предстательной железы, толстой кишки и молочной железы); мутированные и гиперэкспрессированные антигены (например, p53, ras и HER- 2/neu); универсальные антигены (человеческая теломераза, обратная транскриптаза, сурвивин); и вирус-индуцированные антигены (EBV при лимфоме Ходжкина). Получение сильного иммунного ответа на эти антигены – это общая задача терапии с использованием ДК и Т-лимфоцитов [10].
Иммунотерапия с использованием дендритных клеток
Дендритные клетки (ДК) – это популяция мононуклеарных клеток (МНК) костномозгового происхождения, которые в «незрелой» форме присутствуют почти во всех тканях организма. ДК выступают в виде профессиональных антиген-презентирующих клеток (АПК) и обладают высокой способностью стимулировать наивные Т-лимфоциты (а также В-лимфоциты, натуральные киллеры и НК-Т клетки), инициируя первичный иммунный ответ. Они проходят сложный процесс «созревания», вступая в контакт с микроорганизмами, их продуктами или «сигналами опасности» от соседних тканей. При этом происходит их миграция в лимфатические узлы, где ДК представляют подготовленный антиген на молекулах MHC и антиген-презентирующих молекулах, таких как CD1, наивным Т- и В-лимфоцитам. Существует несколько подвидов ДК, но в клинических исследованиях основное внимание обращают на два из них: миелоидные ДК (ДКl; CD1 lc+) и плазмоцитоидные ДК (ДК2; CD1 lc-CD123+).
В значительном количестве клинических исследованиях, в основном, I и II фазы, описывается использование ДК в иммунотерапии злокачественных опухолей (например, неходжкинской лимфомы, меланомы, множественной миеломы, рака предстательной железы, рака почки и молочной железы). В подавляющем большинстве этих исследований использовались миелоидные ДК, происходящие от моноцитов или CD34гемопоэтических клеток-предшественников (ГКП). Антигены доставлялись в различной форме (в виде пептидов, белков, апоптозных клеток, лизата опухолевых клеток, рекомбинантных векторов, сливных ДК и опухолевых клеток). Хотя во многих из этих предварительных исследований были показаны признаки иммуногенности и даже клинического ответа, остается несколько вопросов, на которые ответа не получено, в том числе касающихся оптимальной дозы ДК, оптимального для применения подвида ДК (ДКl или ДК2; способа селекции), сигнала к созреванию, механизма доставки антигена и пути введения [14].
Недавно был опубликован обзор применения ДК в лечении злокачественных опухолей у первой тысячи пациентов. При этом практически не было выявлено побочных эффектов. Клинический ответ был получен примерно в 50% исследований, хотя его выраженность и определение были различными. Нет сомнения, что иммунотерапия, основанная на применении ДК, безопасна, но ее эффективность в монотерапии ставится под вопрос. Вероятно, мультимодальный подход с использованием иммунотерапии ДК в качестве вспомогательного метода, когда опухолевая нагрузка невелика, окажется более эффективным, чем введение ДК в монотерапии. В настоящее время проводятся несколько клинических исследований с использованием такого подхода.
Иммунотерапия с использованием Т-лимфоцитов
Еще один подход к адоптивной иммунотерапии предполагает использование высоких доз Т-лимфоцитов, распознающих антигены, экспрессированные на клетках, пораженных хронической инфекцией, или на злокачественных клетках. Эта концепция успешно применялась в ряде моделей с использованием животных, а также при хроническом миелолейкозе (ХМЛ), где инфузия донорских лейкоцитов (ИДЛ) уже много лет используется для индукции ответа «трансплантат против лейкоза». В качестве источника цитотоксических Т- лимфоцитов могут использоваться как пациенты, так и здоро$ вые доноры (при аллогенной трансплантации стволовых клеток). В использовании Т-лимфоцитов в терапии можно выделить несколько подходов в зависимости от источника лимфоцитов и от тех манипуляций, которыми они подвергаются ex vivo. Возможно использование неизмененных аллогенных донорских Т-лимфоцитов, поликлональных Т-лимфоцитов после активации ex vivo, аллообедненных Т-лимфоцитов, анти-генспецифичных цитотоксических T-лимфоцитов и трансдуцированных Т-лимфоцитов с химерным рецептором [7].
Применение аутологичных лимфоцитов потенциально может быть полезно для индукции опухоль-специфичного цитотоксического действия без токсических побочных эффектов стандартной химиотерапии или аллогенных T-лимфоцитов (например, реакции трансплантат против хозяина). В то же время, существуют потенциальные побочные эффекты использования аутологичных лимфоцитов, такие как синдром лизиса опухоли, который может привести к внезапной сердечной смерти или почечной недостаточности, неконтролируемый выброс цитокинов, ведущий к шоку, и аутоиммунные реакции, включая аплазию и иммунодефициты. Некоторые из этих проблем можно преодолеть, используя генетически модифицированные лимфоциты с введенным «геном суицида», который обычно получают из гена тимидинкиназы вируса простого герпеса. Такие клетки можно уничтожить введением ганцикловира, если побочные эффекты перевесят пользу от вмешательства [11].
Аутологичные лимфоциты, инфильтрирующие опухоль (ЛИО) – это еще один источник цитотоксических Т-лимфоцитов. В опубликованном исследовании ЛИО, полученные от пациента с метастазирующей меланомой, были введены пациенту после экспансии и лечения флударабином и циклофосфамидом в дозах, снижающих уровень лимфоцитов. IL-2 вводили для усиления пролиферации in-vivo. У двоих пациентов был показано полный ответ опухоли и доминирование введенных ЛИО среди лимфоцитов. Это исследование показало, что снижение уровня лимфоцитов in-vivo играет важную роль и может быть ключом к успеху в обеспечении экспансии опухольспецифичных цитотоксических Т-лимфоцитов in vivo [12].
Адоптивная иммунотерапия – это быстрорастущая область, которая находит применение в лечении злокачественных опухолей, трансплантации костного мозга, терапии инфекционных и аутоиммунных заболеваний.
Литература:
1. Phillips K., Gentry T., McCowage G. et al. Cell-surface markers for assessing gene transfer into human hematopoietic cells // Nat. Med. – 1996, № 2. – P.1154–6.
2. Williams D.A. Expression of introduced genetic sequences in hematopoietic cells following retroviral-mediated gene transfer // Hum. Gene. Ther. – 1990, № 1. – P.229–39.
3. Karlsson S. Treatment of genetic defects in hematopoietic cell function by gene transfer // Blood. – 1991, № 78. – P.2481–92.
4. Dao M., Hannum C., Kohn D. et al. FLT3 ligand preserves the ability of human CD34+ progenitors to sustain long-term hematopoiesis in immune-deficient mice after ex vivo retroviral$mediated transduction // Blood. – 1997, № 89. – P.446–56.
5. Donahue R.E., Kessler S.W., Bodine D. et al. Helper virus induced T cell lymphoma in nonhuman primates after retroviral mediated gene transferr // J. Exp. Med. – 1992, № 176. – P.1125–35.
6. Chatterjee S., Lu D., Podsakoff G. et al. Strategies for efficient gene transfer into hematopoietic cells: The use of adenoassociated virus vectors in gene therapy // Ann. NY Acad. Sci. – 1995, № 770. – P.79–90.
7. Chen L., Pulsipher M., Chen D. et al. Selective transgene expression for detection and elimination of contaminating carcinoma cells in hematopoietic stem cell sources // J. Clin. Invest. – 1996, № 98. – P.2539–48.
8. Huang S., Kamata T., Takada Y. et al. Adenovirus interaction with distinct integrins mediates separate events in cell entry and gene delivery to hematopoietic cells // J. Virol. – 1996, № 70 (7). – P.4502–8.
9. Neering S.J., Hardy S.F., Minamoto D. et al. Transduction of primitive human hematopoietic cells with recombinant adenovirus vectors // Blood. – 1996, № 88. – P.1147–55.
10. Marshall E. Gene therapy death prompts review of adenovirus vector // Science. – 1999, № 286. – P.2244–5.
11. Pereira R.F., Halford K.W., O'Hara M.D. et al. Cultured adherent cells from marrow can serve as longlasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice // Proc. Natl. Acad. Sci USA. – 1995, № 92. – P.4857–61.
12. Pittinger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. – 1999, № 284. – P.143–7.
13. Allay J.A., Dennis J.E., Haynesworth S.E. et al. LacZ and inter leukin-3 expression in vivo after retroviral transduction of marrowderived human osteogenic mesenchymal progenitors // Hum. Gene Ther. – 1997, № 8. – P.1417–27.
14. Marx J.C., Allay J.A., Persons D.A. et al. High-efficiency transduction and long-term gene expression with a murine stem cell retro viral vector encoding the green fluorescent protein in human marrow stromal cells // Hum Gene Ther. – 1999, № 10. – P.1163–73.
Источник: Обрезан А.Г., Смолянинов А.Б., Жаров Е.В., Мовчан К.Н.,Адылов Ш.Ф. Клеточные и генные технологии в трансплантационной тканевой инженерии // журнал АГ-инфо 2008-4, с. 11-19
